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Alla fine della parete del Salone dei Cinquecento (quella dov'è l'ingresso), si trova un piccolo capolavoro, lo Studiolo di Francesco I, si tratta di una piccola stanza laterale senza finestre. Progettato dal Vasari e realizzato in stile manieristico tra il 1570 e il 1575.

Le pareti e le volte dello Sutdiolo sono completamente coperte da dipinti, stucchi e sculture della scuola del Vasari e rappresentano i quattro elementi: acqua, terra, aria e fuoco.

I ritratti di Cosimo I e sua moglie Eleonora di Toledo, che si trovano uno di fronte all'altro, furono realizzati dal Bronzino.

Lo studiolo fu ricostruito nel XX secolo dopo che era stato smontato.

La visita prosegue attraverso le sale al primo piano dei Quartieri Monumentali, in queste stanze, è visitabile il Quartiere di Papa Leone X.